蛋白分析仪热卖中

2019-11-03 01:51栏目:仪器仪表
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蛋白分析仪热卖中蛋白分析仪主要用于各种蛋白质的检测,对于多种疾病都有重大意义。介绍全自动特定蛋白分析仪主要用于全血超敏CRP、降钙素原、胱抑素C、D-二聚体等待定蛋白项目检测,其中血浆蛋白的检测具有十分重要的临床意义。在某些慢性疾病的诊断方面,血浆蛋白的检测仍是最早期的诊断指标,如慢性肾病,糖尿病,风湿类疾病等。在全自动特定蛋白分析仪面世初期,传统的检测方法有定性和定性半定量两种。其中定性的有乳胶凝集法,该方法假阳性的机会比较多,很多医院已经淘汰掉了。还有一部分医院采用生化仪在测蛋白的指标,但是生化仪受其方法学的制约只能检测到分子量大的蛋白,如免疫球蛋白和白蛋白。而临床上所需要知道的恰恰是分子量精确到ng/ml或pg/ml的蛋白含量。专业的特定蛋白仪采用的是免疫散射比浊法。 特种蛋白分析仪特种蛋白分析仪是近年来国内常购的临床检验设备。其实特定蛋白的分析无论从思路还是技术上都不能算是新产品。由于观念和临床运用的滞后,使其在国内成了新生事物。使用单一专门化的仪器在国外比较普遍,对于一些非专门化的仪器也常用作单一的测定,如色谱仪,众所周知只要更换分离柱,可以测定多种的成分,但在国外实验室里常用有数十台的色谱仪以避免和减少柱的更换。这样做的好处很明显:首先,能提高效率。由于国外人工成本很高,提高效率成了降低成本的关键,从经济角度是合算的,而国内人工成本低,因而缺少这种意识。其次,能提高检测质量。使用专用仪器可以充分考虑到影响因素,从而在设计、使用上尽量减少误差提高检测量。即使是非专用仪器专用,也可以减少误差,并节约保养和标定成本。就特种蛋白分析仪本身的历史和分析原理看,也很古老,当然随着技术的发展,检测的项目在不断增加。就仪器而言,在国内市场上的相当一部分是国外八十年代,甚至七十年代的产品。特种蛋白分析仪的检测原理基本上是免疫比浊一统天下,差别仅在于结构方式上。可以说,一般生化分析仪也能做。比浊检测是很古老的检测方式,在众多比色分析法中,比浊法是最不具备,光学特异性的,因此应用很少。但由于对特殊蛋白的测定要求反应特异性很高,需使用抗原抗体反应的特异性才能达到要求。而比浊法在酶标技术产生前是免疫技术的基本检测手段,如单扩,双扩都是通过比浊来定性或半定量检测的。这了定量,专门为比浊生产的仪器就出现了,即如今特种蛋白分析仪的前身。比浊法原理:利用光线散射原理,根据雷利散射公式,在一定条件下,透射光与微粒浓度成正比,散射光与微粒浓度成反比。(只适用于低浊度溶液)特种蛋白分析仪从结构上主要分为透射比浊和散射比浊。透射比浊,测定的是透射光和浊度的关系。结构简单,设计容易,但受入射光影响大,灵敏度低。散射比浊,测定散射光和浊度的关系。灵敏度较高,但散射光因微粒大小和性质不同,可呈非均向散射,即不同的角度散射光的强度是不同的,因此利用散射比浊,不同的角度测定特性不同。大致说来,前散射因受血清中白蛋白,脂蛋白的影响小而常用,但不能排除乳糜的干扰。影响免疫比浊的因素:1.抗原抗体比例。抗原抗体比例对复合物的数量和颗粒大小关系极大,当抗体>抗原时成正相关,当抗体<抗原时成负相关。2.抗体纯度和效价。3.增聚剂。在免疫反应中,为增强抗原抗体反应常使用增聚剂,如3-4%的聚乙二醇等,利用其破坏抗原抗体的水化层,促进其靠近反应,但如浓度不适合,高了会影响其它溶质或产生非特异性聚集影响结果。

核心提示:第一讲 免疫浊度技术一、免疫浊度法基本原理免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合,产生一定大小的复合物,形成光的折

第一讲 免疫浊度技术一、免疫浊度法基本原理免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合,产生一定大小的复合物,形成光的折射或吸收,测定这种折射或吸收后的透射光或散射光作为计算单位。

二、免疫比浊法的特点:1、自动化免疫分析稳定性好,敏感性高、精确度高,干扰因素少,结果判断更加客观、准确,也便于进行室内及室间质量控制。2、自动化免疫分析快速、简便,结果回报时间短,便于及时将各种信息向临床反馈,又可节约大量人力物力,利于大批量样品的处理。3、自动化免疫分析能更好地避免标本之间的污染及标本对人的污染。4、自动化免疫分析可利用多道计数器、测光仪,同一份样品同时测定几十种和临床有关的分析项目,血清用量少,具有明显的应用优势。

三、免疫浊度法分类透射光免疫浊度法透射光免疫浊度法是个极简便的方法,测定方式是测定入射光因反射、吸收或散射后的衰减,读数以吸收光单位或OD表示,这种A值反映了入射光和透射光的比率。散射比浊法 散射比浊法应用越来越多,且有替代其他免疫定量法的趋势。散射比浊的原理是根据雷利公式提出的,当复合物较小时呈全透射,透射与散射相当。当复合物大于入射光波的1/20时,形成不对称前向散射,在90o以前的角度测量散射光皆取得最佳效果,散射光的量代表复合物的量。1、终点散射比浊法2、速率散射比浊法 速率法的灵敏度与特异性都优于终点法,前者的灵敏度比后者高出3个数量级之多,但终点法稳定性好。所谓速率,是在某单位时间内形成大于3*10以上的复合物量,当仪器测定到某一时间单位内形成的速率下降时,即出现速率峰,该峰值的高低,即代表抗原的量。 速率散射比浊法有三大特点: 1、时间快,一般在30-60s之内就可完成测试; 2、比较准确,因其测定形成速率,抗原多, 速率快; 3、节省试剂。粒子强化免疫浊度测定法 粒子强化免疫浊度测定法的基本原理是,选择一种大小适中,均匀一致的胶乳颗粒吸附或交联抗体后,当遇到相应抗原时,则发生聚集,单个胶乳颗粒在入射光波长之内,光线可透过。当两个胶乳颗粒凝聚时,则使透射光减少,这种减少的程度与胶乳凝集成正比,当然也与抗原量成正比。

四、免疫比浊法的临床应用检测项目1、免疫功能监测:免疫球蛋白G、A、M,免疫球蛋白轻链κ、λ,补体C3、C4测定。2、心血管疾病监测:载脂蛋白A、B,脂蛋白,C-反应蛋白等。3、炎症状况监测:C-反应蛋白,a-酸性糖蛋白,触珠蛋白,铜蓝蛋白等。4、风湿性疾病检测:ASO、RF、CRP5、肾脏功能检测:尿微量白蛋白,a-微球蛋白,β-微球蛋白,转铁蛋白,免疫球蛋白G等。6、营养状态监测:白蛋白,前白蛋白,转铁蛋白等。7、凝血及出血性疾病的检测:抗凝血酶Ⅲ,转铁蛋白,触珠蛋白等。8、血脑屏障监测:脑脊液白蛋白,免疫球蛋白G、A、M。免疫浊度法测定中应注意的问题1、伪浊度的影响 伪浊度形成原因很复杂,主要是抗血清含有非特异性的交叉反应性杂抗体成分;增浊剂浓度和反应时间掌握不当;样品本身的浊度处理不当;试剂的污染和变质;器材尤其是比色杯等不够清洁等因素。2、非特异性散射光的影响 免疫浊度法经常受内源性光散射的干扰,为避免这些非特异性光散射的影响,应用透射比浊法时需保证抗体组分在3%以下,散射比浊法需保证在 0.5%以下。 3、钩状效应的影响 钩状效应存在于各种免疫测定方法中,在免疫浊度测定中也十分明显。现在很多仪器已具有检查钩状效应的功能,一经发现便可对样品稀释后复测。当病人症状与检测结果明显不符时,应怀疑其存在。

第二讲 固相酶免疫测定技术一、固相酶免疫测定的原理和类型ELISA的原理 基于抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体保持其免疫学活性,抗原或抗体的酶结合物既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,故可极大地放大反应的结果,从而使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂:1、固相的抗原或抗体;2、酶标记的抗原或抗体;3、酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。 二)ELISA反应的类型:1、双抗体夹心法 检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合抗体及杂质。加受检标本,与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时,固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物显色。夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。在临床检验中,此法适用于检测各种蛋白质等大分子抗原,例如乙型肝炎病毒表面抗原、甲胎蛋白、促绒毛膜性腺激素等。双抗体夹心法只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和定量分析,而不能用于半抗原等小分子的测定。2、间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体,故称为间接法。操作步骤如下: 将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 加稀释的受检血清。血清中的特异性抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物,经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合,在洗涤过程中被洗去。 加酶标抗免疫球蛋白(酶标抗抗体,一般为酶标抗人IgG )。它与固相复合物中的抗体相结合,从而使该抗体间接地标记上酶。清洗后,固相载体上的酶量与特异性抗体的量相关。 加底物显色。颜色深度与标本中受检抗体量相关。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。本法的主要缺点为受检标本须经稀释(1:50-1:20)的后才能进行测定,否则血清中高浓度的非特异性IgG和其他干扰物质会引起阴性本底过高,影响结果的判断。3、双抗原夹心法 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。同属抗体检测,与间接法不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。在间接法不适用时(例如包被抗原中的杂质可与酶标记的抗入IgG反应),可试用此法。此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法。在临床检验中,抗HBs的ELISA常采用本法。4、竞争法测抗体 当相应抗原材料中含有与抗入IgG反应的物质,而且不易得到足够的纯化抗原进行包被时,可用此法检测特异性抗体.其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量愈多,结合在固相上的酶标抗体愈少。因此阳性反应呈色较浅于阴性反应。由于抗原的难得,在包被时多采用捕获法,即先包被与抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原。5、竞争法测抗原 小分子抗原和半抗原因缺乏可作夹心的二个或二个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定。竞争法的原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少。因此标本中抗原含量较多的,反应呈色较含量少的为淡。小分子激素,药物等的 ELISA测定多用此法。 6、捕获法测IgM抗体 IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接ELISA一般仅适用于检测IgG抗体。如用酶标记的抗人IgM作为二抗进行间接ELISA测定IgM抗体,标本中同时存在的不同浓度的IgG抗体将与IgM抗体竞争,而使结合在固相抗原上的IGM抗体相应减少。另外标本中如含有类风湿因子、也会产生干扰。因此用一般的间接法测定IgM抗体不能得到准确的结果。在捕获法中,用抗人IgM抗体包被固相,以捕获血清标本中的IgM(其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性IgM)。然后加入抗原,此抗原仅与特异性IgM相结合。继加酶标记针对抗原的特异性抗体,再与底物作用,呈色即与标本中的特异性IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。

二、酶免疫测定的发展和应用ABC-ELISAABC为亲和素、生物素、复合物的略语。亲和素是一种糖蛋白,可以和4个生物素分子紧密结合。可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。生物素与亲和素的结合,虽非属免疫反应,但特异性强,亲和力大,二者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素分子有四个生物素分子的结合位置,可以连接更多的生物素化的酶分子,形成一种类似晶格的复合体。因此如把生物素亲和素系统与ELISA偶联起来,就可大大提高ELISA的灵敏度。ABC- ELISA可分为酶标记亲和素-生物素(labeled avidinbiotin,LAB)法和桥连亲和素-生物素(bridge avidin biotin, BRAB)法二种。前者将酶标记在亲和素分子上;后者通过BNHS分别制成酶-生物素和抗体-生物素,通过亲和素搭桥将二者结合起来。利用生物素-亲和素系统对荧光免疫技术的敏感度也有明显的放大作用。ABC- ELISA已广泛用于细菌、病毒、寄生虫感染等的诊断中。酶联免疫电转移印斑法Burnette于1981年建立酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunolectrotransfer blot, EITB),并称之为西部印斑. EITB分三个阶段进行。第一阶段为SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷,在聚丙烯酞胺凝胶中从阴极向阳极泳动,分子量越小,泳动速度越快。此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带). 第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上。选用低电压大电流,通电45分钟转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。 第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异抗体和酶标记第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使区带染色。阳性反应的条带清晰可辨,并可根据SDS- PAGE时加入的分子量标准,确定各组分的分子量。本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性,是一个有效的分析手段,在蛋白质化学中应用广泛。EITB不仅用于分析抗原组分及其免疫活性,并可用于疾病的诊断。斑点-ELISA 斑点-ELISA 的特点是:1以吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体;2底物经酶反应后形成有色沉淀,使固相膜染色。在实验室中斑点-ELISA可按下法进行。在硝酸纤维素膜上打成4*4mm的小格。在每格的中央,加抗原1-2ul,成为一个小点。干燥后将每格剪下分别放人ELISA板孔内,按 ELISA方法操作,最后加入能形成不溶性有色沉淀的底物,如在膜上出现染色斑点,即为阳性反应。酶免疫电泳 常规电泳结合酶免疫反应,可起到微量抗原定位作用。如在甲胎蛋白检测中,将待测血清在醋酸纤维素膜上进行电泳,因甲胎蛋白含量少,位置邻近白蛋白,用一般染色法难于判定。如将电泳后的醋酸纤维素膜与HRP标记的特异性抗甲胎蛋白抗体共同温育,洗涤后加入底物,在甲胎蛋白处即出现显色条带。电泳结合酶免疫反应的另一种方法,为酶标记抗原对流免疫电泳,用于检测血清中的抗体。方法为将可溶性抗原用酶标记,然后将此酶标抗原与受检血清按常规方法进行对流免疫电泳,最后以底物进行显色,抗原与抗体孔间呈明显的着色沉淀线即为阳性反应,表示有特异性抗体存在。常规对流电泳法中不可见的沉淀带,经酶免疫着色后有时清晰可辨,从而提高阳性检出率。

二、检验项目酶免疫测定具有高度的特异性和敏感性,几乎所有的可溶性抗原-抗体系统均可用以检测。它的最小可测值可达ng甚至pg水平。与放射免疫测定相比,酶免疫测定的优点是标记试剂比较稳定,且无放射性的危害。 酶免疫测定商品试剂检测项目最多的为ELISA,可分以下各类: 1、病原体及其抗体的检测病毒感染如肝炎病毒,巨细胞病毒,风疹病毒,疱疹病毒,轮状病毒,艾滋病病毒等。细菌感染如链球菌,布氏杆菌等。寄生虫感染如阿米巴、弓形虫、锥虫等。 2、蛋白质如各种免疫球蛋白,肿瘤标志物如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺碱性磷酸酶,激素如hCG, FSH, TSH, hGH, 酶如肌酸激酶-MB,其他蛋白质如铁蛋白等。 3、非肽类激素如T3, T4,雌二醇,皮质醇等。 4、药物治疗心脏病药物如地高辛,抗哮喘药物如茶碱,抗生素如庆大霉素等。

第三讲 免疫荧光标记技术一、免疫荧光技术基本原理 免疫荧光技术的原理是利用物质吸收光能后,产生激发态而发光的特性。将具有这种特性的荧光素(异硫氰荧光黄或罗丹明B200)用化学方法结合在特异的抗体或抗原上,又不损害其抗体或抗原活性的一种荧光显微镜下的示踪技术。抗体与抗原的结合是高度特异的,所以只要知道其中的一种因子,也就知道了另一种因子。 免疫荧光技术就是利用上述两种特性,把不可见的抗原抗体的反应与被荧光素标记的抗体反应,变为肉眼可见的荧光,在荧光显微镜下我们所能见到的亮绿荧光,不是标本本身发出的,而是荧光物质受到激发后而发出的亮绿色荧光。二、免疫荧光技术特点1、特异的抗原抗体反应,并与形态学相结合,增加试验的特异性和敏感性。2、利用了物理、化学、组织学、细胞学、生物学等综合性技术,使免疫荧光技术成为一种独立完整的一门方法学。3、一种荧光抗体可以检查多种抗原抗体复合物。4、只要知道一种抗体或抗原,就可以知道其对应的抗原或抗体。三、免疫荧光抗体技术基本类型1、直接法:只有抗原、抗体两个因子直接参与反应,利用荧光标记的特异性抗体与相应的抗原结合,以此来鉴定未知抗原,此方法优点是简单快速,特异性高,非特异性反应少。缺点是一种荧光标记抗体只能针对一种抗原,敏感性较差和不能检查未知抗体。2、间接法:此法是利用荧光标记抗免疫球蛋白 抗体,鉴定未知抗原或抗体。第一步: 用已知抗体、抗原与未知抗原或抗体反应,这步反应是不可见的,反映的沉淀物被固定在组织、细胞上。第二步: 加上荧光标记抗免疫球蛋白的抗体,前抗原抗体沉淀物成为相对抗原和荧光标记抗球蛋白的反应,形成抗原抗体复合物,在根据组织或细胞的发荧光部位来判断。此方法优点是,只要一种标记抗体,能与所有免疫球蛋白对应的未知抗原或抗体反应,敏感性高,缺点是如果抗原或抗体纯度不高,实验可受非特异性荧光干扰。 3、补体法:利用荧光标记抗补体抗体,以鉴定未知抗原或抗体,是补体结合反应的原理。第一步,已知抗体或抗原和未知抗体或抗原反应,第二步,加新鲜补体或新鲜正常人血清反应,第三步,加荧光标记抗补体抗体,则荧光标记抗补体抗体特异的和固定的补体结合。此方法的优点是,只需要一种荧光标记抗补体抗体,就可以检查所有种系的抗原抗体系统。因为补体可被任何哺乳类的抗体抗原系统所固定,并与间接法有同样的优点。缺点是补体不稳定,荧光标记抗补体抗体不能与之固定的补体结合,使试验失败,其次是非特异性荧光强。四、免疫荧光技术的发展与临床应用荧光抗体技术已广泛应用于医学和生物学的很多方面,在临床免疫学中主要用于:1、在细菌诊断中的应用:主要用于鉴定细菌和对抗原结构的研究。如对甲型链球菌的快速诊断和分型鉴定,脑膜炎双球菌的快速诊断等。2、在寄生虫学诊断中的应用:对于疟原虫、阿米巴、利什曼、纤毛虫、滴虫、钩虫、绦虫、蠕虫等均有不少研究。特别是血吸虫及疟原虫的诊断效果是肯定的。可用已知的寄生虫抗原,检查血清中的抗体,用于寄生虫病的诊断和流行病学调查。也可用于寄生虫感染的免疫学和发病机理等方面的研究。3、在病毒学诊断中的应用:免疫荧光技术在病毒领域应用最广泛,并且取得很大成就,主要用于病毒抗原在器官细胞内的定位工作,如HBsAg研究就是一例。也用于病毒感染过程的研究,肿瘤病毒的研究和快速诊断的研究。在快速诊断中对流感病毒的快速检出,对乙脑、狂犬病、脊髓灰白质炎、恙虫病等都取得良好的效果;也可用来检查血清中的抗病毒抗体。4、在免疫病理方面的应用:利用示踪法检查球蛋白的沉积工作已逐渐开展起来,如天庖疮在真皮层基底膜,结节性红斑的沉着在真皮下的纤维层。特别是对于复合物病如:肾小球肾火、类风湿性关节炎、红斑狼疮等利用补体荧光法测定复合物沉着的位置,以了解病变侵犯部位和病变基础。5、血液中B及T细胞的鉴定。6、激素和酶的局部组织定位。7、一些器官移植抗原鉴定。8、组织中免疫球蛋及补体组分的检测。9、在诊断自身免疫病方面的应用:抗核抗体:是自身免疫性疾病最常出现的一种抗体,特别是系统性红斑狼疮,阳性率更高,因此常作为辅助诊断之一,其它如类风湿性关节炎、硬皮病、慢性肝炎等血中亦可出现较高效价的抗体。目前,已将此试验作为许多自身免疫病诊断的重要参考。抗线粒体抗体:在慢性活动性肝炎患者中,如抗体效价在1:256以上可以认为是自身免疫性肝炎。原发性胆汁性肝硬化约有98%出现线粒体抗体,慢性活动性肝炎在31%左右。线粒体抗体在胶原性疾病中可见且效价远较自身免疫性肝炎低。抗平滑肌抗体:这是对平滑肌组织的特异性抗体,没有器官和种属特异性。其临床意义对于自身免疫性肝炎约82%,急性肝炎早期也可出现抗平滑肌抗体,有人报告早于HBsAg出现。甲状腺球蛋白的抗体:甲状腺球蛋白是甲状腺腺泡内主要激素贮存形式,形成胶质蛋白。患甲状腺炎时,有大量甲状腺球蛋白从受损的腺泡中外渗,而形成自身抗原,从而刺激机体产生自身抗体。抗胃壁细胞抗体:具有器官特异性,主要见于恶性贫血和低色素性贫血病人。其他自身抗体:如抗肾小球基底膜抗体,诊断肾小球肾炎。抗横纹肌抗体可用于诊断重症肌无力,抗肾上腺抗体诊断阿狄森氏病。

第四讲 流式细胞术

一、流式细胞术简介 流式细胞术(Flow Cytometry FCM)是一种对单细胞或其他生物粒子膜表面以及内部的化学成分进行定量分析和分选的检测手段,它可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,同传统的荧光镜检查相比,具有速度快,精度高准确性好等特点,成为当代最先进的细胞定量分析技术。自20世纪70年代以来,随着流式细胞技术水平的不断提高,其应用范围也日益广泛。目前,流式细胞已普遍应用于免疫学、血液学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学及肿瘤学等临床医学和基础医学领域。

流式细胞仪集电子技术,计算机技术、流体理论于一体,是一种非常先进的检测仪器。流式细胞仪的发展始于1953年,Parker和Horst设计一种全血细胞计数器装置,该仪器成为流式细胞仪的雏形。其原理是先将全血细胞进行染色,白细胞染为蓝色,红细胞仍为红色,当细胞悬液通过检测细玻璃管时用一束光进行照射,不同细胞所发出的蓝光或红光经过滤光片后分别由两个光电转换器转换为电信号,再由计数电路分别计数。

二、流式细胞仪的组成及工作原理流式细胞仪由五部分组成:1、流动室及液流驱动系统。2、激光光源及光束成形系统。3、光学系统。4、信号检测与存贮、显示、分析系统。5、细胞分选系统。

FCM基本原理 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室,不含细胞的磷酸缓中液在高压下从鞘液管喷出,鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度,这样,鞘液就能够绕着样品高速流动,组成一个圆形的流束,待测细胞在鞘液的包被下单行排列,依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为激发光源。经过聚焦整形后的光束,垂直照射在样品流上,被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。

这两种信号同时被前向光电二极管和90度方向的光电倍增管接收,光散射信号在前向角度10.5-2.0度进行检测,这种信号基本上反映了细胞体积大小;荧光信号的接收方向与激光束垂直,经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离,形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可转换为电信号,再通过模/数转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。

计算机采集所测量得到的各种信号进行计算处理,将分析结果显示在计算机屏幕上,也可以打印出来,还可以数据文件的形式存贮在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体,充电后振动,使喷出的液流断裂为均匀的液滴,待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴以正负不同的电荷,当液滴流经带有几千伏的偏转板时,在高压电场的作用下偏转,落入各自的收集容器中,不予充电的液滴落入中间的废液容器,从而实现细胞的分离。 三、流式细胞仪的临床应用FCM在免疫学中的应用1、外周血T淋巴细胞亚群的测定正常机体中各淋巴细胞亚群相互作用,维持着机体的正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时,可导致免疫紊乱并发生一系列的病理变化。

越来越多的研究表明,T淋巴细胞亚群在某些临床疾病如自身免疫性疾病、免疾缺陷性疾病、变态反应性疾病、病毒感染、恶性肿瘤等均有异常改变。因此,T淋巴细胞亚群的检测对控制这些疾病的发生发展,了解疾病的机制、指导临床治疗都有极其重要的意义。

2、FCM在艾滋病监测中的应用艾滋病,即获得性免疫缺陷综合征,是由于人类免疫缺陷病毒侵犯T辅助淋巴细胞所致。发病后由于病毒在CD4+细胞内繁殖,导致溶解性破坏,致使CD4+细胞数量显著下降,继而累及各免疫功能器官,造成全身免疫功能下降,最终因各种继发性感染和肿瘤而发病死亡。由此可见,CD4+T细胞绝对计数及其在淋巴细胞中的比例对AIDS的检测起着至关重要的作用。

3、细胞内染色和细胞因子的测定人体内的免疫细胞和某些非免疫细胞具有合成和分泌小分子多肽功能,这些小分子参与调节多种生理功能和细胞功能,统称为细胞因子。对细胞因子的研究,有助于在分子水平阐明免疫调节机制,有助于疾病的预防、诊断和治疗,特别是利用相应的细胞因子,在治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫疾病等方面已取得令人满意的效果,前景乐观。因此,细胞因子的检测和研究正成为一个热门题目。

流式细胞术在血液病学中的应用1、白血病免疫分型白血病免疫分型是利用单克隆性抗体检测白血病细胞表面和胞浆内抗原,分析其表现型,以了解被测白血病细胞所属系列及其分化系列,它是研究白血病分化抗原和诊断白血病的重要手段。

从多能造血干细胞分化成熟为功能细胞的过程中,细胞表面和细胞浆内抗原随着分化成熟过程不断发生改变,这些抗原称为造血细胞分化抗原。如,髓系细胞的CD33 、CD13 、CD14、CD15等抗原,巨核系的CD41、 CD42、 CD61等抗原,T淋巴细胞的CD2、CD3、CD4、CD5 、CD7、 CD8等抗原,B淋巴细胞的CD19、CD20、CD22等抗原。

2、淋巴瘤的免疫分型通常淋巴瘤细胞表达B细胞(smIg, CD19, CD20, CD5),T细胞(CD2,CD3,CD5,CD7,CD8,)或T/B细胞表型.这些复杂的表型与细胞形态亚型关系不大,也没有发现一致性的预后意义。它主要用于鉴别诊断,如滤泡性淋巴瘤,主要表达B细胞标志,但不表达CD5,可以区分滤泡性淋巴瘤白血病和慢性淋巴细胞型白血病。

3、白血病微小残留病变和化疗效果的监测 微小残留病变是白血病复发的根源。对MRD的早期监测,可避免复发,延长缓解期。常规检测方法(如形态学检查、组化和血清学检查)难以发现 MRD,只能采用免疫表型、细胞遗传学(FISH荧光原位杂交)和PCR等方法进行检测。由于单纯的分子生物学方法检测MRD具有一定的局限性,而FCM 可以同时定量测定多个参数,结合分选功能,可以分出感兴趣的细胞,进而研究其它分子生物学特性。所以FCM与分子生物学技术相结合可进一步提高检测水平。

4、骨髓移植和干细胞移植的监测移植前监测骨髓和外周血造血干细胞为保证移植重建的成功,每千克体重至少需要1.2×106个CD34+细胞,早期造血重建依赖祖细胞,持久的植活依赖干细胞,因此移植中必须有足够数量不同分化阶段的造血干/祖细胞。CD34+细胞是造血干/祖细胞的特异性标志,联合应用其他分化抗原如CD38, CD33, CDw90, HLA - DR等,用免疫双标记或多重标记法通过FCM可以测定出CD34+细胞总数及各分化阶段干/祖细胞数。

移植后监测免疫功能移植后细胞免疫表型的变化有助于推测骨髓重建是否正常进行,骨髓恢复正常则表现为:自然杀伤细胞增多,并出现少见细胞表型细胞,如NK细胞表达少量CD8、CD5阳性的B细胞,CD4, CD8阴性的T细胞。

5、流式细胞术在免疫血液病中的应用阵发性睡眠性血红蛋白尿症的临床论断 PNH是一种以补体介导的血管内溶血为特征的造血干细胞克隆性疾病。目前研究证明,PNH患者的血细胞膜上缺乏多种糖化肌醇磷脂结合蛋白,如C3转换酶衰变加速因子、反应性溶血膜的抑制物等,致使血细胞对补体异常敏感,出现血管内溶血为特征的一系列症状。

国内大多数医院实验室诊断PNH仍限于溶血实验,此法并非特异性诊断实验,而通过流式细胞仪及免疫荧光技术检测外周血红细胞膜、白细胞膜及网织红细胞膜上CD55和CD59的表达,将是诊断PNH的重要手段。

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